METODY BIOTECHNOLOGICZNE

ĆWICZENIA 4-6

 

METODY BEZTLENOWE OCZYSZCZANIA ŚCIEKÓW.

 

Rozkładane są między innymi zawarte w ściekach związki organiczne nie podlegające utlenieni (a więc oczyszczeniu w warunkach tlenowych), udział biorą te same mikroorganizmy co w metodach tlenowych (np. w naturalnym środowisku odpowiedzialne za oczyszczanie). Rozkład materii organicznej do CO2 i H2O. Proces spalania :  w oddychaniu biologicznym powstaje energia, magazynowana postaci ATP.

Tlen – egzogenny akceptor elektronów.

 

Organizmy tlenowe :

-          ścisłe tlenowce (wymagają stężenia tlenu około 21%)

-          względne tlenowce (rosną w obecności tlenu, ale nie wymagają go bezwzględnie) np. E.Coli

-          mikroaerofile (21 % tlenu to dla nich za dużo, lepiej rosną w stężeniach w granicach 1-15%)

Organizmy beztlenowe :

-          mikroorganizmy beztlenowe aerotolerancyjne (są w stanie tolerować niskie stężenie tlenu ) np. bakterie redukujące siarczany, bakterie fermentacji mlekowej.

-          ścisłe beztlenowce (nawet niewielkie ilości tlenu są dla nich szkodliwe) np. archeony metanogenne, archeony redukujące siarczany, Ptrostridia

 

Jak organizmy beztlenowe zdobywają energię?

-          wykorzystują inny akceptor końcowy elektronów niż tlen : azotany, azotyny, siarczany lub CO2.

 

1.        Oddychanie azotanowe (oddychanie azotanami jako egzogennymi akceptorami elektronów)

Donor elektronu (materia organiczne) + egzogenny akceptor elektronowy

Glukoza + NO3- è NO2- + H2O + CO2 +En (ok. 147 kJ)

 

2.        Azotyny

Mat. Organiczny + NO2- è NO + H2O + CO2 + En

 

Reakcja denytrifikacji : cykl przemian związków azotowych prowadzący do jednoczesnego usuwania azotanów ze ścieków.

NO3- è NO2- è NO è N2O è N2 (do atm.)

 

3.        Siarczany

 

Mat. org. + SO42- è HS- + H2O + HCO3-

W biotransformacji poddawane redukcji do siarczku i jednocześnie usuwane.

(HS- = H2S w równowadze 6,8 –7,2 w zależności od pH)

 

4.        Węglanowe (archeony metanogenne)

Mat org. (C2H5OH) + CO2 è CH4 + 2H2O + En

 

5.        Utleniony wodór

5 H2 + 2 CO2 è CH4 + 2 CH3COO- + En

 

FERMENTACJA

Istnieją także endogenne akceptory  -np. w reakcjach fermentacji! Elektrony odrywane są od glukozy, przekazywane na ATP, dzięki czemu mikroorganizmy zyskują energię (choć niewiele) Produkt fermentacji np. mlekowej – kwas mlekowy to związek, z którym mikroorganizmy nie będą już nic w stanie zrobić.

Pirogronian – jest endogennym akceptorem elektronowym.

(ale mniejszy zysk energii niż w przypadku oddychania tlenowego).

KONSPEKT NA ĆWICZENIA:

Mleczarskie BA –bez akceptora egzogennego.

Powinna zachodzić głównie fermentacja. Duża ilość związków organicznych (wysokie ChZT) . Odczyn środowiska około pH 7,0 go 8,8 (choć ścieki powstające w wyniku produkcji kazeiny i niektórych gatunków sera mają pH 5,5 – 6,5). Składniki : cukry (głównie laktoza), białka (kazeina) i tłuszcze. Związki łatwo dostępne dla mikroorganizmów (choć występują też substancje trudno rozpuszczalne : wody pochłodnicze, detergenty, ewentualnie niewielkie ilości substancji smakowych, dezynfekujących, czyszczących, odtłuszczających) .

Celem ćwiczeń jest porównanie oczyszczenia ścieków :

1.        Mleczarskie BA (sprzyja selekcji bakterii fermentacyjnych i metanogenów)

2.        mleczarskie  + przemysł azotowy (NO2-) –0 denitryfikacyjne

3.        mleczarskie + przemysł azotowy (NO3- ) - denitryfikacyjne

4.        mleczarskie + przemysł metalurgiczny (SO42-) – bakterie red. siarczany

zawierających różne (egzogenne lub endogenne) akceptory elektronów przez beztlenową mikroflorę.

Ścieki o charakterze organicznym :

(zakłady przetwórstwa owocowo – warzywnego, mięsnego, mleczarskie) zawierające związki organiczne łatwo dostępne (węglowodory, kwasy organiczne i białka) jak i trudno dostępne biodegradujące (węglowodory alifatyczne i aromatyczne, pestycydy, herbicydy, związki lignino – sulfonowe i ksenobiotyki)

Ścieki o charakterze nieorganicznym:

(przemysłu azotowego, powierzchniowej obróbki metali)

zawierają takie związki nieorganiczne jak : kwas siarkowy, solny, fosforowy, wodorotlenek sodu, potasu, amoniak, azotany, azotyny, siarczany, sole metali ciężkich, cyjanki, siarkowodór itp.

Skład ścieków z poszczególnych zakładów mleczarskich może różnić się znacznie w zależności od rodzaju wytworzonego produktu. Ze względu na zawartość cukru mlekowego ścieki te łatwo ulegają fermentacji, podczas której następuje zakwaszanie środowiska i wytworzenie toksycznego siarkowodoru. Ilość ścieków odpływających z mleczarni sięga tysięcy m3 / dobę. Na ogólna ilość ścieków mleczarskich składa się między innymi ścieki powstające podczas płukania  produktów oraz mycia naczyń, urządzeń i pomieszczeń oraz słabo zanieczyszczone wody pochłodnicze (60 – 90% ogólnej ilości ścieków)

Ścieki przemysłu azotowego :

W skład ścieków z zakładów wytwarzających nawozy azotowe wchodzą głównie ścieki z produkcji amoniaku, azotanu i siarczanu amonowego. W procesie produkcji powstają trzy grupy ścieków :

-          technologiczne

-          wody powierzchniowe (80-90% powstających ścieków)

-          ścieki z tzw. czynności pomocniczych np. mycia aparatury. Ścieki azotowe zawierają wysokie stężenie amoniaku (do 200 mg N/l), azotanów (do 500 mg N/l) i azotynów (do 80 mg N/l)

Ścieki z zakładów powierzchniowej obróbki metali:

Mają różnorodny skład. Zawierają wszystkie składniki stosowane do odtłuszczania, trawienia, powlekania powierzchni metalowej. Ścieki te zawierają sole takich metali jak  :żelazo, chrom, cynk, nikl, miedź, kadm, ołów itp.. W ich skład wchodzą także siarczany , azotany, fosforany. Odczyn tych ścieków waha się od pH 4-10 . Ścieki pochodzące z operacji przygotowania powierzchni (odtłuszczanie, trawienie) zawierają wysokie stężenie ołowiu (20 mg Pb/l), cynku (10-17 mg Zn/l) oraz siarczany w stężeniu około 1200 mg SO42-/l

 

OZNACZENIA CHEMICZNE

1.        odczyn podłoża

pobrać około 0,3-0,5 ml i umieścić we wgłębieniu płytki porcelanowej. Dodać 3 krople wskaźnika bromotymolowego (oznaczenie pH è porównać barwę ze skalą wzorów)

2.        stężenie N – NH4 metodą Nesslera (mg N/l)

W środowisku alkalicznego roztworu winianu sodowo – potasowego. Powstaje związek o żółtym zabarwieniu, którego intensywność jest proporcjonalna do stężenia amoniaku. W oznaczeniu stosuje się stabilizator  (winian sodowo - potasowy) redukujący ujemny wpływ jonów wapnia, magnezu i żelaza.

Wykonanie:

-          odczynnik Nesslera

-          roztwór winianu potasowego

Przebieg

-          1 ml ścieków do cylindra Nesslera, dopełnić woda destylowana do 50ml, dodać po 1 ml winianu i odczynnika Nesslera, próbę wymieszać i odstawić na 10 minut.

-          Kontrola (woda destylowana + odczynniki)

-          Po 10 minutach odczytać % transmitancji wobec próby kontrolnej przy długości fali 420 nm, stężenie odczytać z krzywej wzorcowej.

3.        N – NO3 (mg N/l)

Metoda oparta na reakcji azotanów z salicylanem sodowym w środowisku stężonego kwasu siarkowego. W reakcji powstaje kwas nitrosalicylowy, który po zalkalizowaniu przechodzi w formę zjonizowaną o żółtym zabarwieniu

Odczynniki:

-          alkaliczny roztwór  winianu sodowo – potasowego

-          wodorotlenek sodowy

-          stężony kwas siarkowy

-          salicylan sodowy roztwór 0,5 %

Przebieg:

Rozpuścić 0,1 g C7H5O3 w 20 ml wody destylowanej. W parownicy (0,002 – 0,05 mg N/No3 è ok. 1 ml próbki) 2,3 krople 0,5 % roztworu NaOH, 1 ml roztworu salicylanu sodu. Parownicę umieścić w łaźni wodnej. Po odparowaniu + 1ml kwasu siarkowego. Po 10 minutach dodać 20 ml wody i 1 ml roztworu winianu sodowo – potasowego.

4.        N – NO2 (mg N/l)

Oznaczenie azotynów w roztworze kwaśnym : tworzą one dwuazozwiązek ulegający połączeniu z α –naftyloaminą w obecności octanu sodowego. Utworzony kompleks ma zabarwienie czerwono – fioletowe, którego intensywność jest proporcjonalna do ilości azotynów.

Odczynniki:

-          kwas sulfananilowy

-          α –naftyloamina

-          octan sodowy

Przebieg oznaczenia:

-          Pobrać po 0,1 – 1 ml badanej próbki i przenieść do 100 ml cylindra Nesslera.. Do cylindra z badaną próbką dolać wody do objętości 100 ml. Następnie dodać po 1 ml kwasu sulfanilowego, próbę wymieszać i odstawić na 5 minut. Po 5 minutach dodać po 1 ml : α –naftyloaminy i octanu sodowego, próbę wymieszać i odstawić na 10 minut. Przygotować próbę kontrolną. Po 10 minutach odczytać wynik przy długości fali 540 nm. Zawartość odczytać z załączonej krzywej.

5.        H2S i siarczków metodą jodometryczną.

Zasada metody : H2S oraz siarczki HS-, S2- redukują dodany ilościowo jod (płyn Lugola) którego nadmiar odmiareczkowuje się roztworem tiosiarczanu sodu wobec skrobi.

Wykonanie:

a)        Odczynniki : 0,05 M płyn Lugola

                                   0,05 M tiosiarczan sodu (Na2S2O3 * 5H2O)

                                   0,5  % roztwór skrobi

b)        Przebieg

-          5 ml ścieków, dopełnić woda destylowana do 200ml

-          dodać w nadmiarze płynu Lugola (aż do uzyskania słomkowej barwy)

-          około 0,5 ml skrobi jako wskaźnika (w obecności wolnego jodu barwi się na niebiesko)

-          odmiareczkować nadmiar jodu tiosiarczanem sodu.

 

Przeliczyć zawartość:

HS- (mg / l) = (a-b)*0,85*1000 // V

a-        objętość dodanego płynu Lugola

b-        objętość dodanego tiosiarczanu

V – objętość badanej próby

Ilość SO42- wyliczyć ze wzoru : SO42- = H2S * 2,82

Gdzie 2,82 = to współczynnik wyliczony ze stosunku mas cząsteczkowych obu związków (96 SO42-  i 34 H2S).

CWICZENIA 2-3

Oznaczenie liczebności bakterii metoda tlenową.

Ilościowe metody określania liczebności mikroorganizmów można podzielić na bezpośrednie (np. liczenie w komorze Thoma, liczenie bakterii na filtrach membranowych) oraz pośrednie (np. liczenie kolonii metodą płytkową na podłożach zestalonych). Oznaczanie liczebności nie pozwala jednak wnioskować o aktywności bakterii oraz o charakterze zachodzących procesów biologicznych. Przemiany różnych związków np. N lub C nie zależą bowiem od liczebności bakterii lecz od obecności określonych grup fizjologicznych bakterii i ich aktywności. W zależności od stopnia zanieczyszczenia ścieków pobiera się różne ilości materiału, przygotowuje się odpowiednie jego rozcieńczenie a następnie na płytki z zestalonym podłożem wykonuje się posiew materiału metodą ti, to jest posiewu powierzchniowego. Po upływie określonego czasu oblicza się ilość wyrosłych kolonii bakteryjnych.

-          pamiętamy o sterylnych (jałowych )warunkach

-          głaskanie (w celu dobrego rozprowadzenia materiału na powierzchni)

-          wysiewamy około 0,1 ml  na szalkę Petrie’yego wyłożona agarem odżywczym.

-          Rozcieńczenie materiału (10-3, 10-4, 10-5 – zmniejszenie ilości mikroorganizmów na jednostkę powierzchni).

 

mleczarskie

pH

N-NH4 (mg/l)

N-NO3 (mg/l)

N-NO2 ()mg/l

SO42-

(mg/l)

ChZT

 

T7

6,9

18

50

8

0

3700

 

T14

6,6

39

7

0

34

1080

 

T21

 

 

 

 

 

 

 

M+ N-NO3

 

 

 

 

 

 

 

T7

6,9

28

310

1

0

1700

 

T14

6,8

17

130

2

51

800

 

T21

 

 

 

 

 

 

 

M+ N-NO2

 

 

 

 

 

 

 

T7

6,9

23

48

231

51

1800

 

T14

7,0

58

25

0

17

860

 

T21

 

 

 

 

 

 

 

M+ metal

 

 

 

 

 

 

 

T7

6,9

47

30

10

34

3200

 

T14

6,7

38

18

0

68

1300

 

T21

 

 

 

 

 

 

 

 

Spadek pH – oznacza fermentację

Brak przyrostu N-NH4 – silnie namnażające się organizmy : wykorzystują go do budowy .